细胞凋亡概述 1 、细胞凋亡概述 （ 1）细胞凋亡的概念 凋亡，也称为程序性细胞死亡，是生物体严格控制的生化过程，通过自然的生理方法达到清除细胞的目的。程序性细胞死亡也是一个切实的调节分化的过程，在发育的过程中或者由于外界条件的作用下（例如感染病毒，基因的突变以及老化的免疫细胞等），很多细胞会被生理性地清除。相反，由于损伤因子引起的持续性自溶则称为坏死。 （ 2）细胞凋亡的原因 分为细胞外原因和细胞内原因。胞外细胞凋亡的信号包括受体的配体，例如细胞坏死因子 (TNF-α), FAS 配体以及非蛋白激活因子比如：钙和自由基等。胞内细胞凋亡的信号包括活性氧（ ROS）， ROS 破坏线粒体的内膜并且导致凋亡。细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶 Caspase, 一条是通过线粒体释放凋亡因子激活 Caspase 可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞的凋亡。 （ 3）细胞凋亡的阶段： 诱导凋亡 Caspase 活性激活 Cytochrome C/apra-1 复合体形成 线粒体膜电位降解 Caspase 活性进一步激活新的 Caspase 酶 细胞膜组成变化 DNA 片段化 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段： 接受凋亡信号 →凋亡调控分子间的相互作用 →蛋白水解酶的活化（ Caspase） →进入连续反应过程。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定 Caspase 即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是 Caspase 不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有 14种 Caspase 被发现， Caspase 分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。 （ 4）细胞凋亡研究应用 • 细胞凋亡的*学研究阶段 1 ）与细胞凋亡的相关基因及调控 2 ）细胞凋亡的信号转导 3 ）与细胞凋亡的各种分子及其相互作用及相互关系 • 在医学方面细胞凋亡的研究热点： 1 ） HIV 感染造成 CD4+ 细胞减少是通过细胞凋亡机制 2 ）从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致 3 ）细胞凋亡的研究将给自身免疫病带来真正的突破 2 、细胞凋亡检测方法以及试剂 （ 1）、前期 ① AnnexinV 检测 在正常细胞中磷脂酰丝氨酸（ PS）分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧，可与 Annexin V，一种分子量为 35~36kD 的 Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白高度亲和结合。凋亡后期、坏死细胞，虽都可与 AnnexinV 结合，但死亡的细胞其细胞膜通透，也可被碘化丙啶（ PropidiumIodide, PI），一种核酸染料染成红色。如将 Annexin V 标以荧光素（如 AlexaFlour488、 FITC）或其他标记物、结合 PI，利用荧光显微镜或流式细胞检测，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 下图流式细胞点图：右下角为 AnnexinV-FITC 阳性、 PI 阴性的凋亡细胞群，左下角为正常活细胞，右上角为坏死细胞。 货号 品名 规格 价格 V13241 Annexin V-AlexaFlour488 /PI double staining kit 1 kit (50 tests) 1908 V13245 Annexin V-AlexaFlour488 /PI double staining kit 1kit (250 tests) 5820 CEL13240 Annexin V-AlexaFlour488 /PI double staining kit 25 次 900 CEL13241 50 次 1500 11858777001 Annexin-V-FLUOS Staining Kit 1 kit (50 tests) 2257 11988549001 Annexin-V-FLUOS Staining Kit 1kit (250 tests) 7281 11828681001 Annexin-V-FLUOS 500 μl 250 tests 5868 3703126001 Annexin-V-Alexa 568 500 μl 250 tests 6359 11828690001 Annexin-V-Biotin 500 μl 250 tests 5868 ② 线粒体跨膜电位检测 近年来研究表明线粒体与细胞凋亡有着密切的关系，而其中线粒体跨膜电位的改变更是认为直接参与调控细胞凋亡的发生发展。线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件。线粒体膜内外的电势差降低，可引起线粒体膜内外一系列的生化改变，如诱导细胞色素 C释放、活化 caspase蛋白酶家族、呼吸链与氧化磷酸化失耦联、三磷酸腺苷合成停止、线粒体膜通透性改变、凋亡诱导因子（ AIF）的释放等，引起细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡。 JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位 △ Ψm 的理想荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时， JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物 (J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时， JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。 虽然 JC-1在许多实验中被广泛地的实验，但是其水溶性差的特性也使其很难在一些实验中使用。卓越的 JC-1替代物 ――JC-10具有更好的水溶性。 JC-10可以选择性地进入线粒体，且由于膜电位的增加，其颜色会发生从绿色到橙色的可逆性改变。这种特性是由于 JC-10聚合物的可逆结构，在膜极化条件下，它的发射光由 520nm(JC-10 单体发射光 )转移到 570nm (J-聚合体发射光 )。当在 490nm处激发时， JC-10发生从绿色到橙绿色的可逆改变。这两种颜色都可以被流式细胞仪上装好的一般滤光器检测到，因此绿色发射光可以通过荧光通道 1（ FL1）进行分析，橙绿色发射光可以通过荧光通道 2（ FL2）进行分析。它除了有潜力用于流式细胞术，也可以用于荧光成像分析。 货号 品名 规格 价格 22204 JC-10  *Superior alternative to JC-1* 5×100 uL 1140 22200 JC-1 5mg 1140 CEL-JC1 JC-1 1mg 768 (2) 后期 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些 Caspase 的底物）在核小体之间剪切核 DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的 DNA 片段。其中经典的 TUNEL（ Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabeling）法应用为大家所接受。其原理为：通过 DNA 末端转移酶将带标记的 dNTP（多为 dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到 DNA片段的 3′-OH 端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。 类别 货号 品名 规格 价格 TUNEL-POD 标记 11684817910 In Situ Cell Death ,POD 50 tests 6380 QIA33-1EA TDT FRAGEL TM DNA FRAGMENT. DETECT. KIT 50 tests 6489 S7100 APOPTAG PEROXIDASE DET. KIT 40 tests 5164 TUN002 In Situ Cell Death ,POD _{roche 分装} 10 tests 1600 TUNEL-AP 标记 11684809910 In Situ Cell Death, AP 50 tests 6152 TUNEL- 绿色荧光标记 11684795910 In Situ Cell Death,FITC 50 tests 5445 QIA39-1EA FLUORESCEIN FRAGEL DNA FRAG. DETECT. KIT 50 tests 4869 S7110 APOPTAG FLUORESCEIN DETECTION 40 tests 5279 TUN001 In Situ Cell Death,FITC 10 tests 1300 TUNEL- 红色荧光标记 12156792910 In Situ Cell Death, TMR 50 tests 4593 S7165 APOPTAG RED DETECTION KIT 40 tests 5279 TUN003 In Situ Cell Death, TMR 10 tests 1300